思睿讲坛第178期:张春阳
作者:丁盼蓝 易春 张郡文 谢慧敏 孙宇洁   来源:青春飞扬    点击数:次   发布时间:2017/06/10
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王升富院长:

各位同学大家上午好,很高兴邀请到张春阳教授到我们学院来指导工作。张教授是1999年中国人民大学博士毕业,然后到清华大学读博士后。2001年起,到美国几所大学进行访学。2009年回国后加入中科院深圳先进技术研究所。现为山东师范大学化学化工与材料科学学院院长。2011年入选中国科学院"百人计划"2013年获国家杰出青年基金,2014年入选深圳市"鹏城学者"特聘教授和广东省"南粤百杰"杰出人才工程,2015年入选山东省"泰山学者"优势特色学科领军人才和科技部创新人才推进计划。主要研究方向为单分子检测与成像及其临床应用研究,在分析化学领域发表了很多文章,最权威的杂志也大量应用。他对我们学院给予了很多的支持和帮助,今天他抽出了宝贵的时间到我们学院来汇报工作,请大家以热烈的掌声,欢迎他!

张春阳教授:

非常感谢王院长的邀请,很高兴来湖北大学参观学习。借这个机会我来汇报一下我们科技团队的研究--在单分子检测领域所做的一系列工作。单分子检测是目前一个比较火的领域,2015年诺贝尔化学奖被授予单分子检测系统开发,近年来都有对单分子领域检测的许多开发。单分子检测,就是在单个分子水平上进行检测和成像,也就是说灵敏度必须达到单个分子水平。要实现单分子检测,有很多种方法。常用的控制角显微镜可以有单分子荧光。前面反射显微镜也可以实现光影显见。先进的仪器都能够进行单分子检测。但是上面说的这些方法存在一些问题。因为你必须要把式样给固定下来,固定在荧光片或者金属上。适合研究一些单分子的物理化学特性,在临床等方面做生化分析。

现在溶液荧光原理是:这儿有一个探针,目标物已知。它的分子量变大则扩散速度就会变慢。荧光科普信号就可以进行关联。利用方程就可以求出它的扩散系数和它的分子量,适合检测溶液中的分子。但是它有缺陷,如果它连接的氮环分子量很大的话,会导致荧光分子不动。那么也许只有一个分子存在,但是你观察到了很多分子。目前做单分子检测比较好的是美国、英国、德国这些国家。还有光显微也在杂志上有发表文章。这些都需要很强的物理背景,要把荧光信号在物理环境下分析。那么对化学来说,做分析是行不通的。在化学的角度 该如何做呢?做单分子检测很重要的是仪器,激光经过一系列光学实验有很小的体积,在这么小的体积内只允许一个分子存在。一个荧光分子的发射,经过一系列的光反应 这个小孔只有五十微米。用特别敏感的检测器,显针管能产生单个光子的检测器。这样我们就能够进行单分子检测。在生化中它有许多优点,我们常用在实验室进行试管分析。理论上很小的数量级,实际上采取分生的样品。

一般我们实验室做实验样品相差十的六次方,一般的荧光分子检测都用的是荧光染料,这些荧光染料分子存在局限性。下一个缺点,单分子检测要找到单个荧光分子在激光下是很难找到它的位置的。如何解决这个问题呢?我们引入了量子体。它与DNA蛋白的大小匹配,它可以感应出它们的大小和成分。光谱可以分辨出不同的荧光。同时检测多种荧光分子。用量子体就要解决它的一些关键问题。

一个半导体如何进行定量是一个比较困难的问题?现在在物理化学上,如何定量子体变量?测它的相关系数和荧光量子量?那既然量子里里可以发光,通过一个就产生一个荧光信号。我们对它的荧光个数进行定量统计。统计它的浓度和个数,就能做出一条标准曲线。怎么样的量子体我们都能够对它进行检测,甚至在现在研究纳米领域。纳米物质是能使用这些来定量分析,研究在杂志上有发表。那么现在讲述一下我们在单分子领域所做的工作,我们做了十几年这方面的工作。分支检测可以用来DNAmicro蛋白。

下面开始汇报,单分子检测用于临床医学的研究。原理是分析化学常用的三明治法。被标记的DNA参与形成一个三明治结构。每个单分子的特异性结合使量子体发光。单分子检测用表面皿copy的单分子进行特异性结合,发光传导性能是非常好的。不同颜色代表不同信号。分析时间非常短,只需要五秒钟。形成的样品就是临床药品,这种药品具有均一性。下面我们接着讲述,单分子检测用于样品检测和筛选。首先要选择一个模型,模型的选择非常重要。我们选择的是抗艾滋病病毒的药理。

艾滋病毒在细胞内的转入和输出必须需要它。它们的结合才能启动转转入速率。两者结合的时候sunfire在其表面。如果这种药物能抑制它的结合,那么sunfire就不能发光。而且我们这种方法是研究内部的结合方式,一比一还是一比二,化学上必须要知道其定量关系。不需要分子成像就能在真实的生物环境下了解组成成分。而且这种药物有很强的荧光特性可以在单分子的情况下对它进行评估。下面我们接着讲述单分子检测,还有什么用途的超长DNA分子。现在一般检测单链DNA都是捆绑法。

它发生的条件是供体跟受体之间的距离必须在两倍的Quantum-esteem范围内,受体只有在两倍的Quantum-esteem,距离之内才能发生,能量才能转移,才能发光,如果超出了不可能发光。那我就大胆的想我就让他远远的超出范围看看,用荧光双色法能不能让它发光。我们可以看到,无论他怎么增加它的光不变化。说明他们之间确实是不能发生荧光控制能量转移。但是我在微流缝隙在单分子检测,我就可以看到,很明显一一对应。为什么接着我们研究机理。我们发现随着流速的增加它的荧光控制能量转移效果在逐渐增强,就说明流速在这里起作用。

为什么改变流苏能导致这样的结果。因为在流体的压力下DNA容易发生变形。那么下面我们接着想检测micro检测可卡因,可卡因大家都知道是一种毒品。它的分子量。这是它的分子式,非常小。现在在公安缉毒上检测可卡因的标准方法是HPLC。拿到样品后要到仪器上才能检测。那我们想我们能不能发展这种方法就可以快速检测可卡因。我们就基于可卡因的特性,让他通过DNA杂交,组装在量子体表面,形成这种复合的三明治结构。这种方法可以用来检测可卡因。但是大家发现这是一个嵌套结构的方式,这个方法在实践样品检测当中,你无法判断sigle-Quantum嵌套出错,是由于操作失误呢,还是带有检测样品的存在。那我们可以想一下发展另外一个方向,把他改变成sigle-2,那么如果把这个sigle-2标记在这个上,我在这个上再加一个去黑剂。没有可卡因存在的情况下,sigle-2不发光,在有可卡因存在的情况下就把这个去黑剂给破坏了。这个是我们用的一个简单的检测可卡因的方法。这是我申请外国专利,唯一一个获得美国专利授权。美国专利授权必须有实际用途而且能带来潜在的业务价值。

下面我们再讨论单分子检测的潜在应用,我们将单分子检测与微流缝隙结合检测生物工程。我们知道微流缝隙中,它的成分是什么。可以改变它的电压。根据你的待测物的表面电隔,就让它的分子在表中心通过同样的生物分子荧光分子。当我们增加分压的时候可以看到他的浓度随之增加,而且聚集在新的表面,就可以超灵敏的检测。而且增大分子色素的排队,这就是我们的芯片。为什么我们制作芯片方法比常规方法好。常规方法两头宽中间特别窄,激光聚集在这个地方这种方法缺点是什么,它容易堵塞。

另外一个方法。加上流体的流速,让它突然变窄,这种方法的局限是必须让流体的流速保持一定。我们这种方法从理论上讲是可行的,实际上也的确可行。上面我们知道检测DNA的常用的方法,大家马上想到PCR扩增。我就跟学生说,我们能不能反其道而行之,我不去扩增目标物,我把他的标志物扩增。如何扩增标志物呢,我就想到了量子点及zang心量点。指示体标记的量子点用来标记target-DNA,那么一个target-DNA就相当于成千的量子点,那么就可以在单分子检测上检测量子点,以前我用一个标志物检测target-DNA,在溶液当中我找到一个分子是很难的。我用成千个量子点去标记,这是我们标志的红色和绿色量子点,我们把它打碎之后发现,量子体的颜色保持不变,单个量子体的大小形状也保持的非常好。实际上我们测量量子理论半径我们用ec感受光法,这样测实际是放大了,运用简单的高中数学可以计算出它确实是成千个量子点,化学问题有时候也需要数学的方法,这是我们的三种检测结果,只有绿色的没有红色的,另外一个是只有红色的没有绿色的,红色和绿色同时存在,而且我们测量时间非常短,只需要5秒,我们成功用于检测艾滋病病毒。

我们知道,在刚刚的分析当中最难检测的是什么?micro,为什么micro最难检测,因为micro分子序列只有21-22个,而且极易降解,现在我们展示一个用同一个量子体检测不同的target-DNA,我们用这种绿色荧光和红色荧光,两种target-DNA同时存在,绿色和红色都组装在target-DNA上,用常规的荧光双色法是没法判断出来研究哪种target-DNA存在,但用双分子检测就非常容易,实际样品检测结果也很好。这个是我们刚才讲到的如何检测micro,那么我们想到,既然micro它序列短易降解,那么能不能把micro信号转化为DNA信号,其实非常简单,我们只要加一个模板,加入这个模板,只要有micro存在,就可以获得很多DNA片段,用单个量子体去检测DNA片段,这种方法灵敏度非常高,而且我们这种方法分辨率比较高,区别也明显。

DNA检测更难的是蛋白质检测,其实每一种蛋白质都存在着顺序,把它的底物找到就可以将分子检测应用于超灵敏检测蛋白质,可用于心脑血管相关方面,巧妙的将蛋白质信号转化为单分子信号,用我们这种方法可以检测各种蛋白质的酶反应,跟标准方法是一致的,我们的方法比常用的方法灵敏度至少提高了一个数量级,那么在蛋白分析中,最难检测的问题是蛋白的翻译于休止,尤其是蛋白的泛素化,蛋白的泛素化非常重要,为什么呢?蛋白的泛素化与唐氏综合征等疾病密切相关,它存在于神经细胞当中,但是它的浓度很低,而且它的总类很多,总是动态变化,那么研究神经生物学,必须需要检测这个,那么如何检测蛋白质泛素化,发展这种单分子检测法,将细胞内的泛素化转换成请各个单分子在绿色荧光和红色荧光下,我们的仪器十分简单,一扫描就可以把光扫描出来,我们的方法跟数学上常用的方法Wester blot结构是一样的,而且我们的方法比Wester blot 法至少灵敏100倍,Wester blot 法把样品稀释5倍,基本上就看不出结果了,我们的方法,稀释500倍照样有检测结果,可以研究不同生命下泛素化的变化过程,那么泛素化之所以重要还在于它存在各种多倍体,比如单倍体、二倍体、三倍体、四倍体、五倍体,这个在生物学上是非常难检测的,可以快速检测出它的三倍体、四倍体、五倍体很有必要。荧光发测多倍体,不同的倍体,测量所需荧光浓度不一样,测量是十分不方便,而使用单分子检测可以简单的就得到结果。

我们可以研究不同的生理现象的多倍体变化特点,我们的方法比较直观,可以提供一种研究分子生物的新方法。为什么我们的方法比较准确呢?我们可以从单分子的角度分析,我们用荧光漂白试剂证明我们看到的就是单倍体,比如说单倍体只能结合一种荧光染色剂,那么用,荧光漂白剂漂白后就只能得到一种,三倍体能够结合三种荧光染色剂漂白后就能够得到三种。我们的方法从理论上来说是准确的,上面说的方法是要把细胞中的DNA和蛋白质提取出来才可以检测,那么我们想一想有没有一种方法能够只需要把细胞混合就能够检测呢?实际上是可以的,我们都知道细胞中有特异性抗体,我们可以找到这些特异性抗体,然后标记上不同的荧光染料,在单分子检测上,绿色和红色可以同时标记,他会表现出什么呢?会表现出黄色,一旦他表现出黄色,就说明它有两种抗体。

那么我们再想一想,能不能不经过任何分离或者生物处理化学处理的方法,同时检测多种癌细胞呢?实际上这也是可以的,我们就以肺癌细胞为例子,我们都知道现在肺癌在国内,是发病率最高的癌症,那么为什么会造成这种情形呢?主要是因为肺癌病毒有多种,每种肺癌病毒都要用对应的药来治疗。如果用错了药的话,就只能造成肺癌细胞的肆意滋生,也就是说判断肺癌细胞的类型是非常重要的。那我们如何对肺癌细胞进行直接检测呢?我们知道,每个癌细胞表面有105次方到106次方个抗原。每种抗原都有各自的特异性,将每种抗原用一种荧光染料来标记,那每一个细胞就可以得到105次方料到10的六次方种荧光染料。然后用物理方法和化学方法处理,在溶液中从成千上万个正常细胞中分离出异常的癌细胞中肯定不容易,但若要想分离出105次方到106次方个荧光染料就要容易得多。我们通过荧光染料分子就可以判断它是哪种肺癌细胞。这种方法的特异性和灵敏度非常高,可以达到一百微升溶液中准确诊断出一个癌细胞的程度。

单分子检测的主要功能是研究一些复杂的生物过程。我们做这篇研究文章的时候,正是这个话题比较热的时候,当时有很多杂志都给出了不同的答案。有人说mcRNA的识别需要完全匹配,但研究表明不完全匹配的时候也能够识别。单分子检测表明就算有紧急错误的时候,它也能够识别。

于是我们就想证明它究竟发生了什么,我们设置了一组实验。利用单分子检测的数据,算出来熵,自由焓,自由能。我们发现mcRNA的识别分三个阶段,每个阶段都很重要那么究竟是哪一个阶段起着关键性的作用呢?结果表明是第一个阶段起了关键作用,并且我们进一步对我们说获得的数据进行了精细的分析。

我们课题组关于单分子检测也发了不少的文章。如果大家有兴趣的话,可以去看一看。这就是关于我们课题组所有工作的报告,如果大家还有什么问题,可以问我。

最后,感谢基金会的支持。谢谢大家!我的学生做实验,我们实验室的工作就是把探针那个黑色的,所做的就是什么呢。你说的这个新型聚合物啊。你做的成功,你发给人家,他就会取用。这是有证明的,就是啊发光的 它的稳定性无论大还是小都可以。他无论试想上提问,你说的那个rna容易降解,就是假如用那个rna打开一个半分子结构,但是打不开,会不会有特殊的溶液。 打开rna吗?你把它当做稀释的。你要用的时候再把它取出来,你必须把它证明,你不证明的话,它一大一小就不行。提问:那个在溶液中是一样大的吗?。所以你要清楚,必须得沉淀。第二,你买的那些化学试剂,都必须是高层次的。这个,你如果它涉及到酶,包括酶的作用,它的rna分子就会转化。但是呢,xxx比较多,氢氧化钠比较少。那个化学特别的溶液,就是把它氧化,只有把它氧化。好,其实这个就是西方用的比较多的,聚焦在一个平面,它的,它不是趋于放射的。中心的吸光强度强,越到边上吸光强度越弱,我有一个芯片,为了知道它吸光强还是不强。如果它被氧化,那么它吸光的强弱就可以判断。但是这些都不重要,我们是光的作用,光对它的氧化作用,所以我计算它的吸光强度,要么用加大的量 。但是它标记的,也可以判断。我只把它取舍当成一样。对设备越熟。对对。但是,我一个量子比,4060的,它的量子比,非常宽的一个范围。那这样的话,我会想当然的觉得。我们应该是这样啊,这个,选择不同的颜色。就是你能够把所有的工作完成,但是我这个量,我弄成一块。你看到的全是你做的,但是我把它透支的,全部拿在一块,就是。提问,你刚才提到了吸光度的问题,就是有没有方法能解决这个问题。对我来讲,这两种方法都有差距,比如用碘来确定的。范围内来讲,应该会多,这两个概念不一样。那个,因为我测了40多个,那个,用那个量子直径,我是去测它的量子直径,它的水化半径,是用那个测的反射光。那么它的反射光,在范围内的直径在实际上是远远大于它本身的。

我用一个直径,我是要去测那个量子直径,是用那个反射光测的,用它的反射光测量子它范围内的直径是远远实际上大于那个的,因为我们的那个量子检测仪。(提问)我有个问题,那个它会提示。因为你那个从那个就等于,那你用的还是实验的结果,因为那个水化半径比较多会溶解到溶液当中,它是有机相,然后通过一个试管取样,它这是一个挨一个的,所以说就是说存在一个误差。西方在这些方面还是有更多的方法的。 这方面工作也很有潜力,在溶液里面这种东西确实是不太好成像,所以说。这种工作其实要说比较好的话,就用吸光度法。现在我们国内,他是让病毒侵入宿主体内,这黄色跟它的里面,他这个外面,比较松,它需要结合,要把它的数据采集出来,还要从那个病毒当中找出规律,还要培养出来,它的那个方程式,应该也是有变化的。

『责任编辑:张筱星』
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